双荧光素酶验证实验

双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。萤火虫荧光素酶是从甲虫（Photinus pyralis）中分离得到，分子量为61kDa；海肾荧光素酶（Renilla Luciferase）则是从海肾（Renilla reniformis）中分离，分子量为36kDa。

  （一）两种酶的区别？

    1.底物和辅因子不同：萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、ATP和镁离子同时存在才能发光；而海肾荧光素酶仅需要腔肠素（coelenterazine）和氧气。

2. 发光的颜色不同：萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色，波长550-570nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，波长480nm。正是由于这两种酶的底物和发光颜色不同，所以在双报告实验中得到广泛应用。

（二）为什么采用双荧光素酶报告系统？

单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。一般情况下，海肾荧光素酶基因作为内参使用，将带有海肾荧光素酶基因的质粒与报告基因质粒共转染细胞；或是将两个报告基因构建到同一个质粒上，分别用不同的启动子启动其表达。计算结果时，将萤火虫荧光素酶的检测值比上海肾荧光素酶检测值（Firefly Luciferase/ Renilla Luciferase），这样就可以减少内在变化因素对实验准确性的影响，相当于做了标准化，使测试结果不受实验条件变化的干扰。

  （三）双荧光素酶报告基因检测有哪些常用的载体？

1. 两种荧光素酶分别位于两个载体上。

比如研究miRNA的靶基因实验时，这两种载体分别为：

（1）pMIR-REPORT载体：它用来插入miRNA靶序列，评估细胞内miRNA功能。该载体包含一个CMV启动子控制下的萤火虫荧光素酶报告基因。在荧光素酶基因的3'UTR区域包含一个多克隆位点，用于插入预测miRNA的结合靶序列或其他核苷酸序列。若荧光素酶活性下降，说明该段插入序列受到miRNA调节，这模仿了miRNA靶序列的作用方式。

（2）pRL系列载体（以pRL-CMV为例），pRL系列载体可在哺乳动物细胞中组成型地表达海肾荧光素酶。

又如，研究转录因子和启动子的实验时，两种载体分别为：

（1）pGL4.20载体，pGL4.20载体含Luciferase荧光素酶报告基因，无启动子，用于研究目的启动子的功能，在荧光素酶基因的上游包含一个多克隆位点，用于插入启动子序列，若Luciferase荧光素酶活性上升，说明该段启动子受到转录因子的调控。

（2）pRL系列载体。

2. 两种荧光素酶位于同一个载体上。这样偏差更小，毕竟转染一个质粒比转染两个质粒要容易，在这方面，根据检索到的资料显示，现在的这类质粒比较有名的是Promega公司的pmirGLO质粒。