外泌体研究技术

外泌体（Exosomes）是一种能被机体内大多数细胞分泌的直径大约为30-150nm的具有脂质双层膜的微小膜泡，包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。它携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。

2013年，发现细胞囊泡运输的调节机制的科学家们，荣获了当年诺贝尔生理学或医学奖。外泌体因诺贝尔医学奖而被众人知晓，也因其作为生命信息传递者，外泌体广泛存在并分布于各种体液中，携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞-细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。在体液中广泛存在及易获得性等特点被誉为液体活检"新贵"，成为疾病的精确诊断和治疗研究的热点，特别是内容物中miRNA、lncRNA、circRNA、蛋白、代谢物等。

外泌体提取方法主要有：超高速离心、密度梯度离心、磁珠免疫、超滤法、聚合物沉淀方法。外泌体提取的质控方法主要有：电镜、NTA粒径、Western blot检测方法（通常由CD9、CD63、CD81、TSG101、HSP70等）。电镜可以观察样品中是否有与外泌体类似的经典结构，如溶酶体、蛋白聚团、支原体等结构。WB检测发现样品中具有外泌体的标志物，可以一定程度上排除溶酶体、蛋白聚团、支原体等情况。NTA粒径分析可以反应外泌体中粒子的群体特征，反映外泌体的含量和纯度。

外泌体具有脂膜结构比较稳定，其内涵的分子在众多领域证明发挥重要作用，同时，外泌体的粒径较小，通透性强，容易到达各种体液中，具体液体活检的巨大潜力，因此外泌体RNA、蛋白、代谢等研究越来越受到重视。

一、外泌体鉴定：电镜、粒径、Western blot

二、外泌体全转录组

全转录组是指特定组织或细胞在特定状态下转录出的所有转录本信息的总和，包含mRNA，small RNA，lncRNA，circRNA等编码和非编码RNA，可以同时获得更多转录数据信息。

三、外泌体蛋白质组

蛋白定量采用非标记定量（Label-free）的方法，通过液质联用技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析，无需使用昂贵的稳定同位素标签做内部标准，只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据，比较不同样品中相应肽段的信号强度，从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。

四、外泌体代谢组

代谢组学是针对细胞、生物体液、组织或生物体中的代谢物、小分子底物、代谢中间体和产物进行的全面研究。利用高效液相色谱串联高分辨率质谱仪TripleTOF 5600 (Sciex)在正、负离子模式下进行样品（包括QC样品）的代谢组检测，结合生物信息分析进行质谱数据解读。生物信息分析主要利用XCMS软件进行物质检测、利用metaX软件进行物质定量、差异物质筛选。分别利用metaX软件对物质一级质谱图、利用in-house图谱库对物质二级质谱图进行代谢物注释。

五、外泌体研究注意事项

不同的样品，外泌体的含量不尽相同，一般情况下，进行外泌体组学研究的起始量为：

细胞上清注意事项：培养基最好使用无血清培养基。

蛋白组代谢组注意事项：

外泌体一般溶于一些基质，而基质中一般含有大量的蛋白、代谢物、或者游离的RNA干扰。在进行外泌体研究中，一定需要把外泌体与基质分离开，避免基质的蛋白、代谢物污染。常用的方法是清洗外泌体沉淀物的时候，采用多次清洗的方法。