Co-IPCo-Immunoprecipitation

免疫共沉淀(Co-ImmunoprecipitationCo-IP)技术是以抗原、抗体间的特异性免疫反应为基础,研究蛋白质间相互作用的经典方法。与其它研究蛋白质相互作用的方法相比,免疫共沉淀是在生理条件下检测蛋白质间相互作用,因此,不仅可以检测到体内形成的天然复合体,而且可排除过表达靶蛋白所带来的假阳性;由于内源性的靶蛋白是完全加工、修饰成熟的蛋白质,因此,依赖于修饰的蛋白质间相互作用也可以被检测到。

实验原理

免疫共沉淀技术原理是以细胞内源性靶蛋白(protein X)为诱饵,将protein X的抗体与细胞总蛋白进行共孵育,促进免疫复合物的形成;随后加入能够与抗体Fc段结合的protein A/G(预先结合固化在琼脂糖微珠上),这样在protein X所在的环境中与其有相互作用的蛋白(protein Y)会被一起沉淀下来,形成"结合蛋白-靶蛋白-靶蛋白抗体-protein A/G微珠"复合物,纯化该复合物后凝胶电泳分离蛋白,应用Western blot 或者质谱技术鉴定靶蛋白的结合蛋白。

 

 

ChIRP( Chromatin Isolation by RNA Purification )

ChIRP( Chromatin Isolation by RNA Purification )是一种同时分析lncRNA/circRNA、蛋白及DNA三者互作关系的实验方法。利用lncRNA/circRNA ChIRP probe可用于在全基因范围内定位lncRNA/circRNA的结合位点和可能结合的其他RNA分子。结合蛋白质谱技术,可鉴定lncRNA在染色质水平所结合的蛋白质。

技术应用:

n  lncRNA/circRNA结合蛋白鉴定

n  lncRNA/circRNA染色体结合位点鉴定

n  lncRNA/circRNA转录调控机制探索

目标分子检测方法:

n  RNANGSqRT-PCR检测

n  DNANGSqPCR检测

n  蛋白:质谱鉴定

 

 

ChIPChromatin Immunoprecipitation

染色质免疫沉淀(ChIP)实验通过组蛋白修饰(表观遗传学)或转录因子-DNA 结合相互作用,监测转录调控,识别基因组和蛋白质组之间的联系。

技术应用:

ChIP-seq:通过特异性抗体(转录因子或组蛋白修饰),将待研究的目标DNA结合蛋白-DNA形成的复合物沉淀下来,从而获取该蛋白结合的DNA。通过对DNA进行高通量测序,即可获得该蛋白在染色体上结合的情况。

ChIP qPCRChIP-qPCR 完美结合了ChIP 技术和实时定量PCR技术。ChIP 技术利用抗体特异性富集与特定转录因子/ 组蛋白修饰结合的DNA 片段;qPCR 技术使用SYBR 荧光染料,特异性的掺入DNA 双链,发射荧光,保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步,最后利用Ct 值进行定量分析。ChIP-qPCR 能够专一,灵敏,快速,高重复地定量生物样品中特定转录因子/ 组蛋白修饰与已知DNA的结合。

 

 

CUT&Tag

CUTTag是“Cleavage Under Targets and Tagmentation”的缩写,是一种用来研究蛋白质和DNA之间的相互作用,并确定目标蛋白质的DNA结合位点的方法,其技术目标和Chip-seq类似。CUTTag中,首先使细胞膜具有通透性,然后加入目标蛋白的一抗孵育,进而和二抗孵育,最后加入proteinA-Tn5和测序接头的复合物。Tn5将通过pA-抗体的相互作用定位到靶蛋白上,然后加入Mg2+激活TN5的转座酶活性,通过转座切割目标蛋白周边DNA并将测序接头连接上去。最后经过PCR即可获得测序文库。

 

 

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